Crio

Nature Communications volume 14, numero articolo: 1775 (2023) Citare questo articolo

1892 Accessi

15 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

Il complesso apicale è un insieme specializzato di macchinari citoscheletrici e secretori nei parassiti apicomplexa, che comprendono i patogeni che causano la malaria e la toxoplasmosi. La sua struttura e il meccanismo di movimento sono poco conosciuti. Abbiamo utilizzato la fresatura crio-FIB e la tomografia crioelettronica per visualizzare la struttura 3D del complesso apicale nei suoi stati protrusi e retratti. Le medie delle fibre conoidi hanno rivelato la loro polarità e l'insolita disposizione a nove protofilamenti con proteine associate che collegano e probabilmente stabilizzano le fibre. Né la struttura delle fibre conoidi né l'architettura del complesso conoide a forma di spirale cambiano durante la protrusione o la retrazione. Pertanto, il conoide si muove come un corpo rigido e non è elastico e comprimibile, come suggerito in precedenza. Invece, gli anelli apicali-polari (APR), precedentemente considerati rigidi, si dilatano durante la protrusione del conoide. Abbiamo identificato filamenti simili all'actina che collegano il conoide e l'APR durante la protrusione, suggerendo un ruolo durante i movimenti del conoide. Inoltre, i nostri dati catturano i parassiti nell'atto della secrezione durante la protrusione del conoide.

Tutti gli agenti patogeni intracellulari devono riuscire ad entrare in una nuova cellula ospite. I parassiti apicomplexa utilizzano un meccanismo di invasione composto da un complesso citoscheletrico specializzato e organelli secretori. Collettivamente, questo gruppo di organelli è noto come complesso apicale. È per questa struttura che prende il nome il phylum Apicomplexa, che comprende gli agenti causali della malaria, della toxoplasmosi e della criptosporidiosi. I parassiti apicomplexa appartengono al superphylum eucariotico Alveolata, come ciliati e dinoflagellati (Figura 1 supplementare). Il complesso apicale è essenziale per la motilità del parassita e per l'invasione e l'uscita dalle cellule ospiti. Inoltre, le mutazioni che interrompono le funzioni del complesso apicale bloccano il ciclo litico degli Apicomplexa, rendendoli non infettivi1,2,3,4.

Il complesso apicale del citoscheletro stesso è una struttura lunga circa 250 nm (circa il 25% della lunghezza di un E. coli) composta da una serie di anelli organizzati attorno a una spirale centrale di fibre di tubulina specializzate chiamata conoide, e all'interno della quale sono organizzati organelli secretori e preparato per la secrezione (Fig. 1a). Sebbene le fibre conoidi siano composte dagli stessi dimeri di tubulina che costituiscono i microtubuli subpellicolari dei parassiti, non formano tubi chiusi5. Le fibre conoidi formano invece una struttura aperta a forma di “C”5. Il complesso conoide è altamente dinamico: sporge e si ritrae6 mentre i parassiti secernono adesine e altri fattori di motilità/invasione7,8. Sorprendentemente, il complesso apicale sembra essersi evoluto da un ciglio eucariotico, poiché contiene sia tubulina che proteine associate al cilio9,10,11,12. Inoltre, il nucleo del complesso apicale, compreso il conoide e le sue strutture specializzate di tubulina, è conservato non solo in Apicomplexa13,14 e in organismi a vita libera strettamente correlati15, ma anche in Alveolati più lontanamente imparentati, come i dinoflagellati16,17 (Supplementary Fig. 1). Pertanto il complesso apicale sembra essere una struttura antica, di cui la composizione molecolare, la struttura ad alta risoluzione e la comprensione meccanicistica delle sue funzioni sono ancora in gran parte un mistero.

una panoramica dei componenti del complesso apicale coccidico confrontando gli stati protruso e retratto. Questo schema di colorazione verrà utilizzato in tutto il manoscritto. b Sezione tomografica attraverso un conoide parzialmente retratto che è stato fresato crio-FIB in orientamento in sezione trasversale, mostra chiaramente gli SPMT che terminano vicino all'anello AAD e con proiezioni AAD (frecce viola) intervallate da SPMT vicini. c Sezione tomografica dell'estremità apicale ricostruita di N. caninum con conoide sporgente. Notare la densità che collega le due membrane del complesso della membrana interna (IMC, punte di freccia ciano). Per altre etichette e colorazioni, vedere sotto. d Segmentazione 3D e visualizzazione del complesso apicale da un conoide sporgente (tomogramma diverso da (c)). Etichette e colori utilizzati in tutto il manoscritto se non diversamente specificato: AAD (viola), anello di densità amorfo associato ad APR e proiezioni; filamenti simili all'actina (magenta in (c)); APR (rosso), anelli polari apicali; Fibra conoide CF (arancione), microtubuli intraconoidali ICMT (verde chiaro), complesso della membrana interna IMC (ciano), anelli pre-conoidali PCR (gialli), membrana plasmatica PM (grigio), microtubuli subpellicolari SPMT (verde scuro). e Sezione tomografica dell'estremità apicale ricostruita di un N. caninum fresato con un conide retratto, annotato come in (c). f Segmentazione 3D e visualizzazione di un conoide retratto (tomogramma diverso da (e)) e colorato come in (d). Nelle viste longitudinali, la punta apicale è orientata verso la parte superiore delle immagini in tutto il manoscritto, se non diversamente specificato. Barre di scala: 100 nm (in b – e).

1-μm thick; to avoid cell flattening by water surface tension). We then used cryo-FIB milling to generate 150–200 nm-thick lamellae of the vitrified, but otherwise native, parasites (Supplementary Fig. 3). To generate these samples, we used the NC1 strain of Neospora caninum, which is a BSL1 organism closely related to the human pathogen Toxoplasma gondii (Supplementary Fig. 1). The conoid of extracellular parasites protrudes and retracts continuously—with and without host cells present, but just before plunge-freezing, the parasites were either prepared in an intracellular-like buffer37 or incubated with 10 μM calcium ionophore for 10 min. so that the majority of parasites have conoids, preferably in the retracted or protruded states6, respectively, without blocking conoid motility or cellular functions like secretion. The resulting cryo-tomograms reveal well-preserved structural details of the native N. caninum apical complex, including membranes, cytoskeletal assemblies, and organelles (Fig. 1 and Supplementary Movie 1)./p>

0.05)./p>1 μm in length, and likely require a more intricate machinery than simple membrane docking to drive secretion. Intriguingly, depolymerization of actin using cytochalasin D blocks parasite motility and invasion but not host cell attachment and rhoptry secretion65, suggesting actin is not responsible for driving secretion. Recent work identified the apicomplexan Nd proteins that comprise the "apical rosettes", structures best characterized in the ciliate group of Alveolata27. Similar to their role in ciliates, the apicomplexan Nd proteins are essential for rhoptry secretion26, and the rosette structure was recently described using cryo-ET of unmilled parasites51. The Toxoplasma protein Ferlin-2 is also required for rhoptry secretion50, and we and others51 identified a density spiraling around the rhoptries within the conoid that is reminiscent of the published Ferlin-2 immuno-EM staining pattern50. These spiraling filaments may act somewhat like dynamin to squeeze the rhoptries during secretion. Among the Toxoplasma Nd-associated proteins were putative GTPase-related proteins26, suggesting a dynamin-like activity may be present at this site as well./p>

1 μm) layer of ice. It is challenging to determine the apical vs. basal ends of the ice-embedded cells in the cryo-FIB milling instrument. Secondly, during the cryo-FIB milling step, the ice thickness was reduced from more than 1 μm to 150–200 nm, removing more than 80% of the volume. Thus, the probability of placing the lamella exactly in the region of the about 300 nm wide conoid is relatively low compared to accidentally milling the apical complex away during the thinning step. Finally, about 10–15% of lamellae were damaged or surface-contaminated during the transfer step from the milling instrument to the TEM. Future application of fluorescence-guided cryo-FIB milling and autoloader systems for more direct transfer of FIB-milled samples into the TEM could address these issues and increase experiment throughput./p>

Notizia