Preparazione ad alta efficienza di vescicole extracellulari derivate dalla membrana plasmatica monodispersa per applicazioni terapeutiche

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 478 (2023) Citare questo articolo

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Le vescicole extracellulari (EV) sono molto interessanti per la progettazione di terapie di prossima generazione. Tuttavia, i loro metodi di preparazione devono affrontare sfide in termini di standardizzazione, resa e riproducibilità. Qui, descriviamo un metodo di preparazione di EV altamente efficiente e riproducibile per vescicole di membrana nano plasmatica monodisperse (nPMV), che produce da 10 a 100 volte più particelle per cellula e ora rispetto ai metodi convenzionali di preparazione di EV. Gli nPMV sono prodotti omogeneizzando le vescicole giganti della membrana plasmatica in seguito al sanguinamento della membrana cellulare e alla secrezione apoptotica del corpo indotta da fattori di stress chimici. Gli nPMV non hanno mostrato differenze significative rispetto agli EV nativi della stessa linea cellulare nell'analisi crio-TEM, nelle interazioni cellulari in vitro e negli studi di biodistribuzione in vivo nelle larve di pesce zebra. La proteomica e la lipidomica, d'altra parte, hanno suggerito differenze sostanziali coerenti con l'origine divergente di questi due tipi di EV e hanno indicato che gli nPMV derivano principalmente da vescicole extracellulari apoptotiche. Gli nPMV possono fornire una fonte interessante per lo sviluppo di terapie farmaceutiche basate sui veicoli elettrici.

Le vescicole extracellulari (EV) sono vescicole membranose derivate dalle cellule, che trasportano lipidi specifici della cellula, proteine ​​(cioè enzimi, molecole di adesione cellulare, cluster di proteine ​​di differenziazione (CD)), acidi nucleici (cioè vari RNA e DNA), metaboliti , organelli e talvolta anche virus1,2. Gli EV sono classificati in due categorie principali in base alla loro biogenesi: esosomi ed ectosomi2. Gli esosomi sono piccoli EV (40–150 nm di diametro), provengono dal compartimento endosomiale della cellula e vengono continuamente rilasciati nell'ambiente circostante dalle cellule procariotiche ed eucariotiche attraverso l'esocitosi di corpi multivescicolari o anfisomi2,3,4. Gli ectosomi, d'altra parte, si formano per gemmazione/sbavatura diretta della membrana plasmatica e comprendono un ampio gruppo di diversi tipi di vescicole tra cui microvescicole, corpi apoptotici (ApoBD), vescicole extracellulari apoptotiche (ApoEV) e grandi oncosomi. Gli ectosomi hanno dimensioni molto variabili che vanno da 50 a >1000 nm2,5,6. Sulla base dei risultati dell'analisi proteomica e lipidomica, è stato dimostrato che i veicoli elettrici hanno un'impronta molecolare definita ereditata dalle cellule del loro donatore (progenitore)7,8. Negli organismi viventi, possono interagire con cellule distanti dalla loro origine, essere interiorizzate per rilasciare il loro contenuto e indurre cambiamenti fenotipici comprese alterazioni negli eventi di segnalazione2,9,10. Ai fini della somministrazione di farmaci in modelli cellulari e animali, sono state proposte diverse strategie per caricare gli EV con acidi nucleici terapeutici, proteine ​​o farmaci a basso peso molecolare11. Mentre la maggior parte della ricerca sui veicoli elettrici nel campo delle applicazioni terapeutiche è ancora in una fase preclinica, una piccola parte sta progredendo verso studi clinici sull’uomo12,13. Nonostante il grande interesse per le tecnologie basate sui veicoli elettrici (e in particolare sugli esosomi), i progressi sono rallentati non solo, ma in parte a causa delle sfide legate alla produzione su larga scala. I tassi tipici di secrezione di EV sono di appena 60-170 particelle/cellula/h e la produzione dipende fortemente dal tipo di cellula utilizzata14,15. Pertanto, la produzione di grandi quantità di veicoli elettrici richiede quantità sostanziali di cellule donatrici e richiede molto tempo. Inoltre, l’isolamento, la purificazione e il sottofrazionamento dei veicoli elettrici prodotti stanno ostacolando il processo16. La situazione è ulteriormente complicata dalle differenze tra i protocolli e le condizioni sperimentali utilizzate dai singoli laboratori. Pertanto, le società di EV stanno sviluppando linee guida per la standardizzazione dei metodi di produzione e caratterizzazione per accelerare la ricerca preclinica e, in definitiva, la traduzione clinica delle terapie basate su EV12,17. Sono stati studiati diversi approcci per aumentare la resa dei veicoli elettrici. L'estrusione meccanica o lo stress di taglio di cellule intere hanno generato rese più elevate di nanovescicole simili a EV con proprietà fisico-chimiche e biologiche simili agli EV nativi18,19. Inoltre, lo stress delle cellule donatrici ha aumentato sostanzialmente la secrezione di EV in vari modelli20,21,22,23,24. A causa delle limitazioni dei protocolli standard di preparazione degli EV di laboratorio, lo scopo del presente studio era quindi quello di sviluppare un metodo efficiente per la preparazione di EV monodispersi con elevata riproducibilità. Vescicole giganti della membrana plasmatica (GPMV) sono state prodotte dall'apoptosi cellulare indotta da stress chimici e dal successivo blebbing della membrana. È stato esplorato l'utilizzo dei GPMV come materiale di partenza (Fig. 1) per la produzione di veicoli elettrici. Successivamente, la dimensione dei GPMV è stata ridotta mediante estrusione producendo vescicole di membrana plasmatica nano (nPMV). Gli nPMV sono stati quindi caratterizzati fianco a fianco con EV nativi isolati dalla stessa linea cellulare donatrice per confrontare le loro rese e velocità di produzione, proprietà fisico-chimiche, morfologia 2D e 3D (utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione criogenica, cryo-TEM), composizione molecolare (proteomica e lipidomica), interazioni cellulari in vitro e biodistribuzione in vivo utilizzando larve di pesce zebra transgeniche (Tg) (ZFL) come modello farmacocinetico dei vertebrati.