Miglioramento di una terapia batterica viva sintetica per la fenilchetonuria con biosensore

Nature Communications volume 12, numero articolo: 6215 (2021) Citare questo articolo

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Nei pazienti con fenilchetonuria (PKU), un difetto genetico nell'enzima fenilalanina idrossilasi (PAH) porta a livelli elevati di fenilalanina sistemica (Phe), che possono provocare gravi danni neurologici. Come trattamento per la PKU, il ceppo SYNB1618 di Escherichia coli Nissle (EcN) è stato sviluppato nell'ambito della piattaforma Synthetic Biotic™ di Synlogic per degradare la Phe dall'interno del tratto gastrointestinale (GI). Questo ceppo ingegnerizzato in fase clinica esprime l'enzima fenilalanina ammonia liasi (PAL) che metabolizza il Phe, catalizzando la deaminazione del Phe nel prodotto non tossico trans-cinnamato (TCA). Nel presente lavoro, generiamo un ceppo PKU più potente basato su EcN attraverso l'ottimizzazione dell'attività PAL della cellula intera, utilizzando lo screening ad alto rendimento basato su biosensori delle librerie PAL mutanti. Un candidato enzima principale da questa schermata viene utilizzato nella costruzione di SYNB1934, un ceppo cromosomicamente integrato contenente le caratteristiche aggiuntive di metabolizzazione del Phe e di biosicurezza presenti in SYNB1618. Nel confronto diretto, SYNB1934 dimostra un aumento di circa due volte dell'attività PAL in vivo rispetto a SYNB1618.

La malattia metabolica fenilchetonuria (PKU) è caratterizzata dall'assenza o dall'interruzione della funzione dell'enzima fenilalanina idrossilasi (PAH). I pazienti affetti da PKU non sono in grado di metabolizzare l'aminoacido fenilalanina (Phe), con conseguente accumulo sistemico. Livelli elevati di Phe possono portare a gravi complicazioni neurologiche e disabilità se non trattati. Fortunatamente, la PKU viene diagnosticata attraverso lo screening neonatale da oltre 50 anni e, se la malattia viene rilevata e trattata entro le prime settimane di vita, è possibile mitigare le gravi disabilità1.

Poiché la Phe è un amminoacido essenziale, la sua assunzione nei pazienti può essere controllata attraverso la restrizione alimentare delle proteine; tuttavia, molti pazienti non riescono a raggiungere un'aderenza duratura a causa della natura rigorosa della dieta. Infatti, l’interruzione della dieta PKU in età adulta è stata collegata a una marcata riduzione delle funzioni esecutive e al disturbo depressivo maggiore2,3. Oltre al controllo dell’assunzione di Phe attraverso la gestione della dieta, esistono due opzioni di trattamento farmacologico approvate. Una di queste opzioni, la sapropterina dicloridrato (KUVAN, BioMarin Pharmaceutical), è un attivatore di PAH per i pazienti con PKU sensibile alla tetratidrobiopterina (BH4). La sapropterina è un analogo del BH4 che fornisce un cofattore aggiuntivo e/o promuove il ripiegamento produttivo dell'enzima mutante PAH. Tuttavia, a causa del suo meccanismo, la sapropterina è efficace solo nel sottogruppo di pazienti con PKU che presentano attività PAH residua, che si stima costituisca circa un terzo della popolazione con PKU4,5. Anche nei pazienti responsivi alla BH4, la sapropterina viene raramente utilizzata come terapia unica e deve essere combinata con una gestione dietetica parallela6. L’altra opzione di trattamento, Pegvaliase (Palynziq, BioMarin Pharmaceutical), consiste in un enzima pegilato degradante il Phe, la fenilalanina ammoniaca liasi (PAL), iniettato sistematicamente. Tuttavia, questa terapia è stata associata a segnalazioni di gravi reazioni avverse immunomediate e anafilassi7,8. Permane la necessità di opzioni terapeutiche sicure per via orale per i pazienti con PKU che soddisfino le esigenze dell’intera popolazione di pazienti indipendentemente dall’età o dal background genetico.

Recentemente si è registrato un significativo interesse per l'applicazione della biologia di sintesi alla progettazione e all'ingegnerizzazione di organismi probiotici in grado di esercitare funzioni terapeutiche dall'interno del tratto gastrointestinale (GI)9. Abbiamo precedentemente riportato la costruzione e la caratterizzazione del prodotto bioterapeutico vivo (LBP) SYNB1618 per il trattamento della PKU10. Questo ceppo geneticamente modificato di Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) esprime enzimi, tra cui PAL (StlA) da Photorhabdus luminescens e l-aminoacido deaminasi (LAAD) da Proteus mirabilis11, destinati a degradare il Phe alimentare ed enterroricircolante in metaboliti non tossici all'interno del Tratto gastrointestinale (rispettivamente acido cinnamico12,13 e fenilpiruvato14). È stato segnalato che SYNB1618 riduce significativamente la Phe plasmatica nei topi Pahenu2/enu2 (un modello murino di PKU) e previene significativamente un picco della Phe plasmatica nei primati non umani sani (NHP) a cui è stato somministrato un bolo proteico10. SYNB1618 è stato valutato in un primo studio randomizzato, controllato con placebo, condotto su volontari sani e pazienti con PKU, in cui il ceppo si è rivelato sicuro e ben tollerato, con aumenti dose-responsivi dei metaboliti Phe specifici di SYNB1618 nel plasma e urina15.