Le microcapsule di gel di agarosio consentono un facile

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 17014 (2022) Citare questo articolo

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Un nuovo tipo di microcapsula di gel di agarosio (AGM), costituita da un nucleo di sol di picolitro di alginato e un guscio di gel di agarosio, è stato sviluppato per ottenere DNA genomico di batteri amplificato, unicellulare, di alta qualità. L'AGM è facile da preparare in un'emulsione stabile con olio di densità equivalente all'acqua, che impedisce l'aggregazione dell'AGM, solo con attrezzature di laboratorio standard. Singole cellule provenienti da una coltura pura di Escherichia coli, una comunità fittizia comprendente 15 ceppi di batteri intestinali umani e una comunità batterica intestinale di termiti sono state incapsulate all'interno di AGM e i loro campioni di DNA genomico sono stati preparati con amplificazioni massivamente parallele in una provetta. Il sequenziamento del genoma non ha avuto bisogno di un’amplificazione di secondo turno e ha mostrato una completezza media del genoma molto superiore a quella ottenuta utilizzando un metodo di amplificazione convenzionale su scala microlitica, indipendentemente dal contenuto genomico di guanina-citosina. Il nostro nuovo metodo che utilizza l'AGM consentirà a molti ricercatori di eseguire la genomica di un'unica cellula in modo semplice ed efficace e potrà accelerare l'analisi genomica di microrganismi non ancora coltivati.

I microrganismi sono distribuiti ubiquitariamente in ambienti diversi. Sono spesso associati ad altri organismi e svolgono un ruolo importante negli ecosistemi. Tuttavia, la maggior parte delle specie microbiche è difficile da coltivare con i metodi convenzionali e sono chiamati microrganismi non ancora coltivati1. Negli ultimi due decenni, sono stati ampiamente studiati utilizzando metodi indipendenti dalla coltura come l'analisi del sequenziamento degli ampliconi dei geni dell'RNA ribosomiale a piccole subunità (SSU rRNA) e l'analisi del sequenziamento shotgun dei metagenomi. La metagenomica è un potente strumento per studiare le funzioni ecologiche e fisiologiche del microbiota sulla base dei loro repertori genetici codificati. Il recente sviluppo del raggruppamento computazionale dei frammenti metagenomici nei rispettivi insiemi tassonomici microbici ha rafforzato l'utilità della metagenomica2,3. Tuttavia, il binning computazionale basato sulla composizione della sequenza, sull'omologia con le sequenze del database e sulla copertura della lettura della sequenza di ciascun frammento può spesso non riuscire a discriminare i genomi di (sotto)specie strettamente correlate e a ordinare correttamente le regioni genomiche che mostrano caratteristiche distinte da altre, come l'rRNA geni, profagi e plasmidi4,5. Inoltre, è necessario un massiccio sforzo di sequenziamento per ottenere le sequenze del genoma delle specie minori nella comunità microbica3.

La genomica unicellulare, in cui l'intero DNA genomico viene amplificato da singole cellule fisicamente isolate6, è stata utilizzata come metodo alternativo o complementare per rivelare la capacità metabolica di microrganismi non ancora coltivati1,7. L'isolamento di una singola cellula può essere ottenuto in molti casi utilizzando tecnologie come lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)1, i micromanipolatori8, i dispositivi microfluidici9,10 e l'incapsulamento in goccioline di acqua in olio11. Sebbene siano stati sviluppati vari metodi per l'amplificazione dell'intero genoma12, l'amplificazione a spostamento multiplo (MDA) utilizzando la DNA polimerasi phi29 con primer casuali è ampiamente utilizzata grazie alla sua relativa semplicità, affidabilità e applicabilità6,13. Tuttavia, l'MDA dimostra intrinsecamente un'estrema distorsione dell'amplificazione tra le regioni del genoma1, che ha rappresentato la principale limitazione tecnica nella genomica unicellulare. Inoltre, l'elevato contenuto di guanina-citosina (GC) del DNA genomico tende ad aumentare il bias di amplificazione1,14. Il bias di amplificazione può essere soppresso utilizzando piccoli recipienti di reazione; ad esempio, camere a microcanali (60 nL)10, micropozzetti da nanolitri (12 nL)15, microfluidica virtuale (MDA in un foglio di gel, 60 nL)16, goccioline digitali generate utilizzando un microcanale (9,5–240 pL)17,18, 19 e perle di gel20. Tuttavia, queste tecniche di microfabbricazione non sono disponibili per molti microbiologi e la quantità del prodotto di amplificazione è spesso troppo piccola per il sequenziamento diretto del genoma; pertanto, spesso è necessario un secondo ciclo di MDA, che in definitiva aumenta il bias di amplificazione21.